第一章：分子克隆实验概述

分子克隆技术是生物医学研究领域中被广泛应用的实验方法之一，研究人员可以利用该技术将DNA片段通过体外重组的方式构建入载体中。此后，通过转化操作将重组载体引入合适的宿主细胞中进行复制和扩增，最终筛选得到符合实验需求的载体克隆。

XPJ分子克隆实验概述与方法探讨

一、分子克隆实验方法

分子克隆实验通常需要将特定的DNA片段插入到载体中形成重组质粒。根据不同的实验目的，可以将常见的分子克隆技术分类为：

入门克隆：如TA克隆、TOPO克隆。
定向克隆：如同源重组、酶切连接（黏性末端双酶切反应）。
定点突变：包括碱基的插入、缺失与改变。

1. 酶切连接

酶切连接是构建载体的一项重要技术，利用限制性内切酶（特指TypeII型限制性内切酶）和T4 DNA连接酶，使得DNA片段与载体实现重组连接。限制性内切酶按照其结构复杂程度和识别序列的不同，分为四类，其中TypeII型限制性内切酶能够特异性识别双链DNA序列，切割位点位于识别序列内部或其附近，水解核苷酸链中的磷酸二酯键，从而生成特定的DNA片段（5’端为磷酸基团，3’端为羟基）。

T4 DNA连接酶能够催化5’磷酸基团和3’羟基末端之间的连接，生成磷酸二酯键。在进行酶切连接时，首先需要对载体和DNA片段上的酶切位点进行分析，确保它们使用相同的限制性内切酶进行消化。使用PCR方法在目的片段的两端引入线性化载体所需的酶切位点，随后对质粒/载体和扩增片段进行消化，接着使用T4 DNA连接酶进行连接，经过感受态细胞转化、筛选等环节，最终得到重组质粒。

该方法通过双酶切线性化可以实现定向克隆，同时也能灵活选择载体；然而，有时找到合适的酶切位点及组合的难度或限制性内切酶的低效切割可能会对实验进展造成影响。

2. TA克隆

TA克隆技术是将PCR扩增的DNA片段与带有3’-T突出端的载体连接，通过感受态细胞转化、筛选等操作获得重组质粒。利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移活性，在双链PCR产物的3’末端添加一个A碱基，与处理过的线性化载体进行T/A配对及T4 DNA连接酶的作用进行连接。这种方法快速高效，但对平末端产物的连接不兼容，针对使用高保真酶扩增的平末端产物需要额外的加A反应。

3. TOPO克隆

TOPO克隆利用拓扑异构酶的催化作用实现目标片段与线性载体的连接，通过感受态细胞转化、筛选等步骤得到重组质粒。拓扑异构酶I的特点在于同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能，80%的连接反应在2分钟内完成，无需外源能量。TOPO酶能够切割DNA链并与3’端的T形成共价键，使DNA解旋，随后通过线性化DNA片段5’端羟基的进攻形成共价键，从而释放出TOPO酶。为此，载体需先经过TOPO酶线性化处理，然后加入DNA片段进行重组连接。

4. 同源重组

同源重组技术利用重组酶对两段具有末端序列一致的序列进行重组，形成环形双链DNA，在随后的感受态细胞转化和筛选操作中得到重组质粒。在该系统中，需事先创建同源区域，通过扩增插入片段的正向和反向PCR引物，延长出15-20bp的碱基，使其与线性载体末端序列完全匹配，从而使扩增出的插入片段与线性载体末端序列同源。Vazyme的ClonExpress同源重组核心酶Exnase识别同源序列并发挥重组功能，该方法快速高效，不依赖酶切和连接，使得定向克隆变得更加简单。

5. 定点突变

定点突变是通过PCR等方法向目标DNA片段（特指质粒）引入所需的碱基变化，包括碱基的插入、缺失与改变。传统的定点突变系统采用一对互补引物进行质粒PCR扩增，突变位点设置在引物中间。然而，这种方法在模板需求上较大，且可能存在假阳性问题。现在的MutExpress（Vazyme）点突变系统基于ClonExpress快速克隆技术，利用一对部分互补的引物进行PCR扩增，突变位点则位于引物的互补区域，优化了模板需求量，并且DpnI可全面消化，成功率显著提高。

DpnI切割原始模板质粒的原理是基于DpnI特异性识别模板GATC序列，只有甲基化的A碱基才能被DpnI切割。由化学感受态细胞（如DH5α、Fast-T1等）提取得到的质粒可被DpnI消化，而PCR产物因不含甲基化修饰而不受影响。

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